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本试剂盒是采用高效标记的探针和敏感性加强型原位杂交检测试剂盒，原位杂交实验的成功率大大提高，操作更简便。

• 有条件应尽可能用新鲜标本，并及时进行固定。固定液为4%多聚甲醛(0.1MPBS，PH7.0～7.6)含0.1%DEPC。因为mRNA类基因容易降解。
  
• 标本的消化对原位杂交比较重要，适当的消化将使靶基因充分暴露，增加探针的接触性。但过度的消化将使标本明显减薄乃至消失。不同的标本对消化的敏感性不同。常用的消化酶有蛋白酶K和胃蛋白酶。大量标本实验前，应仔细摸索最佳的消化条件。蛋白酶K的消化条件为10μg/mL(0.1M TBS,PH7.2～7.6)，37℃消化1～5分钟。
  
• 杂交后的洗涤对信号/背景/强度有密切关系，洗涤时间越短，信号越强，背景也越高；洗涤时间超长，信号越低。适当的洗涤时间会获得理想的信号强度和可以忽略的背景染色。
  

工作量：100张切片。
适用种属：大鼠、小鼠、人
标记方式：3’—尾段标记

组分	规格
胃蛋白酶(×10;Pepsin)	2mL
预杂交液	2mL
Growth hormone/GH mRNA原位杂交试剂盒寡核苷酸探针杂交液	2mL
封闭液	5mL
生物素化鼠抗地高辛	5mL
SABC-POD	5mL
生物素化过氧化物酶	5mL

保存：4℃，有效期1年。

• 原位杂交专用盖玻片；
  
• POLY-L-LYSINE；
  
• DEPC；
  
• 20%甘油
  
• 缓冲液(3%柠檬酸，2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC，原位杂交用PBS)

一、培养细胞和冰冻切片

• 准备工作：
  固定液：4%多聚甲醛/0.1M PBS(PH7.2～7.6)；1%多聚甲醛/0.1M PBS(PH7.2～7.6)
  3%柠檬酸：100mL蒸馏水中加柠檬酸(C6H8O7·H2O)3g,PH2.0左右。
  2×SSC：1000mL蒸馏水中加氯化钠17.6g，柠檬酸三钠(C6H5O7Na3·2H2O，分子量294)8.8g。
  0.5×SSC：300mL蒸馏水加100mL 2×SSC即可。
  0.2×SSC：270mL蒸馏水加30mL 2×SSC即可。
  20%甘油：20mL甘油加80mL蒸馏水即可。
  原位杂交用PBS(1000mL蒸馏水加氯化钠30g,Na2HPO4·12H2O 6g,NaH2PO4·2H2O 0.4g),PH7.2～7.6。
  
• 操作程序：
  注意：最重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
  
  • 玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10～20μm。
    
  • 细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
    
  • 培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚甲醛/0.1M PBS(PH7.2～7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定20--30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
    
  • 30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合，室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
    
  • 暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1mL 3%柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化5～120秒钟。有时也可以不消化。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
    
  • 后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1M PBS(PH7.2～7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定10分钟。蒸馏水洗涤3次。
    
  • 预杂交：湿盒的准备：干的杂交盒底部加20%甘油20mL以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38～42℃2～4小时。吸取多余液体，不洗。
    
  • 杂交：按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38～42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
    
  • 杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃ 0.5×SSC洗涤15分钟×1次;37℃ 0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1～2次)。
    
  • 滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗
    
  • 滴加生物素化鼠抗地高辛：37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
    
  • 滴加SABC：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
    
  • 滴加生物素化过氧化物酶：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
    
  • DAB显色：使用DAB显色试剂盒—1mL蒸馏水加显色剂A，B，C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20～30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
    
  • 必要时苏木素复染，充分水洗。
    
  • 酒精脱水，二甲苯透明，封片。

二、石蜡切片
如果有条件的话，应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后，及时予以固定。固定液为4%多聚甲醛/0.1M PBS(PH7.0～7.6)，含有1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过4mm的小块，固定1小时即可，较大的标本固定不要超过2小时。某些组织对过度固定尤其敏感，如动物大脑，固定时间30～40分钟，一般不要超过1小时。

• 常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6～8μm。
  
• 玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。
  
• 石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O2 1份+蒸馏水10份混合，室温5～10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。
  
• 暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1mL 3%柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化3～30分钟(视标本新旧、厚薄自行调整)。用户可以比较不同的消化时间，例如5分钟，10分钟，20分钟，30分钟。以找到最佳的消化时间。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。其余步骤和冰冻切片6～16步相同。

Growth的细胞胞浆着色呈棕黄色。


由于特定的mRNA序列仅占总mRNA的极少数，加上基因仅由四个碱基排列组合而成，因此原位杂交容易出现非特异性染色。通过不加探针和用阴性标本做对照，基本可以确定染色是否为特异性的。有明显的非特异性染色现象时，用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释，一般稀释2～10倍；并应加强探针杂交后的洗涤。如果有少量的细胞核着色属于正常情况；如果出现大量的细胞核着色，往往和标本固定时间过长有关，应重新处理标本。
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